Объектив для микроскопа - это основной и наиболее технически сложный узел любого светового микроскопа. Он состоит из множества элементов. Именно на него ложится главная функция - построение изображения. На итоговый выбор объектива влияет масса параметров: сфера применения, габариты исследуемого объекта, требуемое разрешение, работа с иммерсией или без нее, нужное рабочее расстояние, тип тубуса, способ коррекции изображения, методы контрастирования, наличие покровного стекла, схема освещения и многое другое. Все эти моменты стоит заранее сопоставить со своими задачами, иначе есть риск получить либо слабое по качеству изображение, либо объектив без необходимых возможностей.
Вся оптика делится на две группы: линзовую (классическую) и зеркальную.
Линзовая оптика работает на преломлении света и снабжена просветляющим покрытием, которое подавляет паразитные отражения от поверхностей и тем самым повышает светопропускание. Внутри этой группы есть разделение на объективы проходящего света (преимущественно биологические и минералогические - для прозрачных образцов) и отраженного (металлографические). Первые в принципе можно поставить на микроскоп отраженного света, но делать это нежелательно: внутри объектива возникают незапланированные отражения и блики, ухудшающие картинку. Вторые же одинаково хорошо работают и в отраженном, и в проходящем свете. Линзовая оптика очень распространена и отлично проявляет себя в видимом спектре, но из-за физики оптики неизбежно подвержена аберрациям (искажениям). Эту проблему снимают зеркальные объективы.
Зеркальная оптика построена на паре зеркал - первичном и вторичном: свет, прошедший через образец, попадает на первое зеркало, отражается на второе и уходит в окуляры. Такая схема делает оптический блок компактнее. Вдобавок зеркальные объективы различают более тонкие детали, ведь качество картинки определяется лишь зеркальным покрытием. Еще одно их достоинство - способность строить изображение за границами видимого спектра, в УФ- и ИК-диапазонах, где линзовая оптика заметно теряет качество из-за падения пропускания.
Объективы также делят на конечные (рассчитанные на фиксированную длину тубуса) и бесконечные (скорректированные на бесконечность). Длина тубуса - это промежуток между гнездом турели объективов, куда устанавливается объектив, и положением окулярной трубки. Бесконечные схемы более дорогие, зато между тубусом и объективом можно ставить дополнительные модули: анализаторы, ДИК-слайдеры, флуоресцентные осветители. Признак оптики высокого класса - парфокальность, когда при смене объектива объект остается в фокусе (у большинства производителей парфокальное расстояние равно 45 мм или 60 мм). Иначе говоря, переключившись, например, с 5x на 63x, вы по-прежнему видите образец в фокусе. Особенно это важно на больших исследовательских штативах с моторизацией.
Большинство характеристик нанесено прямо на корпус объектива в виде маркировки: увеличение, числовая апертура, рабочее расстояние, длина тубуса, поправка на покровное стекло. Прочие параметры либо рассчитываются, либо берутся из спецификаций производителя.
Для самостоятельного выбора объектива Вам необходимо ответить на приведенные ниже вопросы.
- Каковы размеры образцов (какое требуется увеличение)?
Увеличение - самый первый параметр при подборе оптимального объектива. На корпусе оно указано числом с буквой «x» (кратность). Чаще всего объективы выпускают в диапазоне от 4x до 100x, хотя встречаются и 1,25x, и 150x. Итоговое изображение дополнительно увеличивается окулярами, поэтому общее оптическое увеличение получается умножением кратности объектива на кратность окуляров.
Если нужно детально изучить живые клетки и вручную их посчитать, обычно берут объектив 40x и выше (с окулярами 10x это 400-кратное увеличение). Если же речь о пайке под стереомикроскопом, то к базовым 40x, наоборот, добавляют уменьшающий объектив 0,3x - получается итоговые 12x.
- Детали какого минимального размера предстоит наблюдать?
Второй важнейший параметр - числовая апертура (NA), описывающая способность объектива собирать свет. По значимости она нередко даже превосходит увеличение, поскольку именно от числовой апертуры зависит разрешающая способность объектива, глубина резкости и яркость. Чем она выше, тем больше света захватывает объектив, а значит, тем ярче и детальнее картинка.
Яркость растет пропорционально квадрату NA, но падает пропорционально квадрату увеличения. При этом в производстве увеличение и NA, как правило, повышаются совместно. Поэтому даже при большой апертуре заметного прироста яркости может не быть - его «съедает» возросшее увеличение (хотя разрешение все равно улучшится).
Большая числовая апертура особенно важна при наблюдении мельчайших структур и при регистрации очень слабых флуоресцентных сигналов. Так что, задаваясь вопросом «насколько мелкие объекты удастся различить?», в первую очередь смотрите на числовую апертуру (ее значения лежат в пределах от 0,04 до 1,7): чем она больше, тем более тонкие детали можно различить.
- Какие требования к полю зрения и глубине резкости?
Диаметр поля зрения (или просто поле зрения) - это размер участка, видимого в окуляр. Его измеряют в миллиметрах в промежуточной плоскости изображения. У большинства современных микроскопов он составляет от 18 мм (самые простые модели) до 27 мм (а с широкопольными окулярами и больше).
Глубина резкости - осевая характеристика (вдоль оптической оси Z), задающая интервал между плоскостями, в пределах которого изображение остается одинаково четким (его еще называют оптическим срезом). Все, что выходит за этот интервал, оказывается не в фокусе и требует перефокусировки. Важно помнить: при большой NA глубина резкости минимальна. Поэтому, чтобы «пройти» резкостью по всей толщине образца, фокусировку приходится менять заметно сильнее, чем при малой NA, - ведь оптический срез тоньше.
- Какое нужно разрешение объектива?
Разрешение объектива - это минимальное расстояние между двумя точками образца, которые еще видны раздельно. Разрешающая способность прямо пропорциональна длине волны света и обратно пропорциональна числовой апертуре: чем выше NA, тем больше света собрано и тем ближе друг к другу могут быть различимые точки. Отталкивайтесь от своих задач и спросите себя: какие минимальные структуры мне необходимо видеть раздельно?
- Какого рабочего расстояния будет достаточно?
Рабочее расстояние - это промежуток от фронтальной линзы объектива до ближайшей поверхности покровного стекла, когда образец находится в фокусе. Этот параметр обратно связан с увеличением и NA: чем они выше, тем рабочее расстояние короче. Чтобы на фронтальную линзу попадало больше света, объективы и проектируют с малым рабочим расстоянием.
Иногда его не хватает. Например, при исследовании образцов в чашке Петри на инвертированном микроскопе объектив 100x не дотягивается: чашки обычно делают из толстого пластика, и объектив фокусируется в ее дно из-за короткого рабочего отрезка. Бывают и хрупкие образцы или образцы с неровной поверхностью. Близко подведенный объектив рискует повредить их или повредиться сам. Под такие случаи выпускают объективы с увеличенным рабочим расстоянием, расплачиваясь за это снижением числовой апертуры. Свободное пространство нужно и при пайке под стереомикроскопом или иных манипуляциях, поэтому там применяют уменьшающие объективы с большим рабочим расстоянием.
- Если образец флуоресцирует - насколько сильный сигнал?
При слабой флуоресценции лучше брать объективы с большой числовой апертурой: они собирают больше света. Кроме того, объективы различаются по длине волны возбуждающего света - от ультрафиолета до инфракрасного. Стекла линз пропускают разные длины волн неодинаково, поэтому, чтобы возбуждающий свет нужной длины волны проходил через объектив максимально полно (что критично для флуоресценции), оптику в идеале подбирают именно под него.
- Флуоресценция одноканальная или мультиканальная?
Для борьбы с хроматическими аберрациями существуют разные типы объективов, отличающиеся типом коррекции: ахроматы, полуапохроматы (флюары) и апохроматы. Наименее скорректированы ахроматы (продольная хроматическая аберрация исправлена для синего и красного, сферическая - для зеленого). Следующая ступень - полуапохроматы или флюары (название происходит от плавикового шпата, флюорита, который раньше применяли при их изготовлении): у них хроматическая аберрация исправлена для красного и зеленого, а сферическая - дополнительно для 2–3 цветов. Это дает большую числовую апертуру и, соответственно, более яркую картинку. По разрешению и контрасту они превосходят ахроматы, что удобно для съемки в белом или флуоресцентном свете.
Для мультиканальной флуоресценции рекомендуются апохроматы. Их коррекция - наивысшая из доступных за счет более сложной конструкции: хроматически они исправлены для 3–5 цветов, сферически - для 3–4 длин волн. Благодаря этому у них самая большая ЧА, и они идеальны для съемки и в белом свете, и во флуоресценции.
Устройство объективов с разной хроматической коррекцией
Естественно, чем сложнее объектив и выше степень коррекции, тем он дороже. Поэтому нередко выгоднее остановиться на «золотой середине» - полуапохроматах.
Все три типа, впрочем, страдают от кривизны поля: изображение получается не плоским, а искаженным. Этот дефект усиливается с ростом увеличения и обусловлен формой линз. Чтобы от него избавиться, разработали объективы с плоским полем, где фокус одинаков и в центре, и по краям кадра. У них минимальная дисторсия и исправленная кривизна поля, а называют их планахроматами, планфлюарами и планапохроматами - в зависимости от уровня коррекции. Такая продвинутая оптика стоит дороже, но при цифровой съемке ее преимущество очевидно, что делает ее весьма ценной во многих задачах.
- Какой метод наблюдения вы используете? Нужно ли повышать контраст?
Не каждый объект одинаково хорошо виден в светлом поле. Если перед вами толстые, чересчур тонкие, прозрачные или двулучепреломляющие образцы и т.п., понадобится тот или иной метод контрастирования: темное поле, флуоресценция, дифференциальный интерференционный контраст (DIC), фазовый контраст, поляризация, а также их вариации. Эти методы применяют повсеместно - как в проходящем свете (кроме флуоресценции), так и в отраженном (кроме фазового контраста). Объективы под каждый метод конструируют по-особому, а сведения о методе контрастирования указаны на самом объективе. В темном поле проявляются тонкие прозрачные структуры (в проходящем свете), а фазовый контраст помогает выделить тонкие неокрашенные объекты с разным показателем преломления. Объектив для фазового контраста узнается по зеленой надписи «Ph» с числом (0, 1, 2 или 3 — в зависимости от размера фазового кольца). Дифференциальный интерференционный контраст маркируют как DIC, а поляризационные объективы имеют красную маркировку и надпись «Pol».
- В какой среде находится образец?
Большинство объективов рассчитано на воздушную среду - между образцом и фронтальной линзой остается воздушная прослойка. Но немало моделей создается и для иммерсии: у них повышенный показатель преломления, что позволяет преодолеть «воздушный» предел числовой апертуры 0,95 (за счет более полного сбора света) и тем самым поднять разрешающую способность. В роли иммерсионной среды может выступать вода, масло или глицерин. Под каждый образец подбирают свою иммерсию, и правильный выбор иммерсионного объектива принципиален, ведь он сильно сказывается на качестве картинки, особенно при больших увеличениях.
- Какова толщина покровного стекла, если оно используется?
На качество изображения объективов с большой NA заметно влияют оптические свойства и толщина среды между образцом и фронтальной линзой. Иммерсионные объективы изначально рассчитаны на иммерсию, покровное стекло и среду с образцом, поэтому все эти слои можно условно считать продолжением фронтальной линзы - и расчет оптики с коррекцией оказывается несложным. А вот у «сухих» объективов отклонение толщины покровного стекла от стандартных 0,17 мм дает пропорциональную сферическую и хроматическую аберрацию, причем чем больше NA, тем сильнее портится картинка.
Свои тонкости есть и у иммерсионных объективов: если образец в водном растворе находится далеко от покровного стекла, а используется масляный объектив, возникают сильные аберрации и объект «размазывается» вдоль оптического пути. Именно поэтому в одних случаях предпочтителен объектив с масляной иммерсией, а в других - с водной.
Покровные стекла нередко бывают нестандартной толщины. Чтобы это компенсировать, выпускают объективы с корректировочным кольцом: вращая его можно изменять расстояние между внутренними линзами и подстраивать объектив под конкретную толщину покровного стекла. Существуют и объективы, которые поворотом кольца можно перенастроить под разные типы иммерсии.
Вы можете купить объектив для микроскопа в Москве в компании Лабтех по наименьшей цене.
